Анализ крови на маркеры системной красной волчанки

Лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний

Способы получения моноклональных антител

Получение моноклональных антител — это сложный многоступенчатый процесс, который проходит следующие этапы:

  1. Иммунизация животных. Обычно используются мыши или крысы. Это нужно для того чтобы увеличить количество лимфобластов — клеток, продуцирующих нужные антитела и перевести эти клетки в активное состояние. После выделения из организма эти клетки не могут долго существовать в лабораторных условиях, они погибнут даже на питательных средах с содержанием ростовых факторов. Чтобы это предотвратить, их скрещивают со злокачественными миеломными клетками.
  2. Подготовка миеломных клеток. Параллельно с иммунизацией животных проводят подготовку опухолевых миеломных клеток. Они, во-первых, обладают способностью синтезировать моноклональные антитела, а во-вторых, обладают неограниченным жизненным потенциалом (они бессмертны и способны к бесконечному воспроизведению). Для того чтобы миеломные клетки не погибли вне организма, их культивируют на специальных средах с использованием факторов роста.
  3. Гибридизация (слияние) лимфобластов и миеломных клеток для образования гибридомы. Для этого клетки обрабатывают различными антителами, чтобы изменить строение их мембран и спровоцировать образование цитоплазматических контактов. При этом образуются разные типы клеток, имеющих двойной набор хромосом (дикарионы). Это могут быть дикарионы, образованные только лимфоцитами, или только миеломными клетками. Но для производства моноклональных антител нужны именно дикарионы, образованные лимфоцитом и миеломной клеткой — гибридные клетки.
  4. Отбор гибридных клеток. Для этого используют специальные растворы, которые позволяют выжить только лимфобластным и гибридомным дикарионам. Первые в скором времени погибают, т. к. не обладают возможностью безграничного деления, а гибридомные клетки остаются жизнеспособными.
  5. Реклонирование гибридомных клонов.
  6. Определение и отбор гибридом, продуцирующих моноклональные антитела. Обычно для этого используется иммуноферментный анализ.
  7. Массовое наращивание антител.
  8. Очистка полученных антител. Степень очистки будет определяться областью применения препарата. Если это диагностика, достаточно 70-95% степени чистоты. Если препарат предполагается использовать для иммунотерапии, требуется более высокая степень чистоты. Для очистки используется аффинная и ионообменная хроматография.
  9. Удаление оставшихся примесей и обеззараживание полученного препарата от вирусов и бактерий.

В настоящее время идет тенденция отказа в использовании антител животных для лечебных целей. Во-первых, они являются чужеродными агентами для организма и могут спровоцировать аллергические реакции, вплоть до анафилаксии, что напрямую угрожает жизни пациентов. Во-вторых, иммунная система человека, распознавая такие антитела как чужеродные, будет пытаться их инактивировать, что снизит эффективность противоопухолевого лечения. Получить человеческие моноклональные антитела вышеописанным методом не представляется возможным, ввиду следующих проблем:

Способы получения моноклональных антител
  • Иммунизация человека различными антигенами неэтична.
  • Даже если получить иммунизированные лимфоциты человека, будут проблемы на этапе их слияния с клетками миеломы мыши — полученные гибридомы будут нестабильны.
  • Клеточные линии миеломы человека, которые можно было бы эффективно использовать в рамках биотехнологий для получения антител, пока получить не удалось.

В этой связи необходимо было искать новые технологии получения антител. Решением проблемы стали гибридные, гуманизированные и одноцепочечные антитела, производство которых подразумевало применение гибридомной технологии, кратко описанной выше, и технологии рекомбинантной ДНК.

  • Гибридное или химерное антитело — это антитело, в котором его константный домен заменен на иммуноглобулин человека. Получаются они посредством технологии рекомбинантной ДНК, когда удаляется фрагмент мышиной ДНК, отвечающей за синтез константного домена и меняют его на фрагмент человеческой ДНК. Таким образом, в антителе в качестве константного домена, который обладает иммуногенными и эффекторными свойствами, будет человеческий белок, что позволит организму воспринимать его «за своего», а вариабельный домен, который специфически взаимодействует с антигеном, останется мышиным. Все вместе это позволит сохранить специфичность и уменьшить аллергенность и иммуногенность применяемого препарата.
  • Гуманизированное антитело содержит еще меньше мышиного белка за счет только антигенсвязывающих гипервариабельных участков вариабельного домена. Это еще больше снижает вероятность осложнений со стороны иммунной системы.
  • Одноцепочечное антитело представляет собой минимальный фрагмент антитела, который еще в состоянии хорошо связаться с антигеном и оказать свое действие. Он не содержит константного домена вообще.

Анализ на антиядерные антитела

В клеточном ядре соединительной ткани человеческого организма содержится около ста антигенов, это — гистоны, нуклеиновые кислоты, белки ядерной мембраны, рибонуклео-протеины, компоненты сплайсосомы и многие другие. При различных системных патологиях организм вырабатывает гетерогенную группу аутоиммунных антител, которые направлены против различных компонентов собственных ядер. Они называются антиядерными (или антинуклеарными) антителами.Появление антиядерных антител в плазме крови связывают с распадом клеток при системных аутоиммунных патологических процессах, в результате которых происходит повышение реактивной чувствительности соединительной ткани к нуклеарным (или ядерным) антигенам.Скрининг антинуклеарного фактора необходим при диагностировании системных заболеваний: билиарного цирроза, системной красной волчанки, склеродермии. Исследование используется также в диагностике эндокринных, инфекционных и онкологических патологий.

Показания для назначения анализа

Анализ на антиядерные тела рекомендуют опытные специалисты-ревматологи, нефрологи, терапевты, педиатры при наличии у пациента клинических признаков аутоиммунных процессов:

  • повышение температуры тела в течение длительного времени без проявления других клинических симптомов воспаления;
  • боли в суставах;
  • высыпания на коже;
  • слабость и повышенная утомляемость;
  • почечная недостаточность;
  • увеличение печени и селезенки;
  • воспаление легких;
  • эпилепсия.

Анализ также проводят для мониторинга лечения системной красной волчанки и для оценки состояния пациента.

Методика проведения анализа

Для исследования используют кровь из вены, отбор проводится в утренние часы в манипуляционном кабинете лечебного учреждения.Сложной подготовки к анализу не нужно, пациенту желательно:

  1. Исключить моральные и физические перегрузки.
  2. Ужинать накануне не позже 21 часа.
  3. Утром не завтракать и не курить.
Читайте также:  10 лучших лекарств от сухого и влажного кашля

Медицинский персонал лаборатории должен выяснить — не принимает ли пациент медикаменты, оказывающие влияние на результат анализа, такие как: карбамазепин, нитрофурантоин, нифедипин. В случае положительного ответа, необходимо поставить в известность врача-лаборанта — эти препараты способны вызвать появление лекарственной волчанки.Исследование проводят с использованием качественного иммуноферментного анализа, который является самой современной методикой скрининга антинуклеарного фактора. В ходе теста антиядерные антитела обнаруживают с помощью конкретного типа ядерных антигенов, которые зафиксированы на твердых носителях.

Интерпретация результатов

Нормальным показателем считается результат: «Антинуклеарный фактор — отрицательный». Причинами положительного результата является наличие:

  • системной красной волчанки;
  • аутоиммунного гепатита или панкреатита;
  • ревматоидного артрита;
  • болезни Рейно (синдрома «холодных рук»);
  • миастении;
  • аутоиммунного поражения слезных и слюнных желез (синдрома Шегрена);
  • системного дерматосклероза (склеродермии);
  • злокачественных патологий;
  • малярии;
  • инфекционного мононуклеоза;
  • диффузной интерстициальной болезни легких.

При наличии сомнительного результата («серой зоны») пациенту рекомендуют пройти повторный скрининг антиядерного фактора через 14 дней.

Поликлональные антитела

Поликлональные антитела – это антитела, которые вырабатываются в сыворотке крови. Для их получения чаще всего используется кровь иммунизированного животного – чаще всего это кролик, но иногда используется сыворотка барана или козы. Поликлональные антитела гетерогенны на различных уровнях: по классу и подклассу антител, их титру, аффинности и специфичности. Из одного образца поликлональных антител можно получить лекарственные средства, содержащие антитела ко многим антигенам, к нескольким антигенам, либо к одному антигену. Соответственно, такие свойства называются поли-, олиго- и моноспецифичность.

Поликлональные антитела имеют сравнительно низкую стоимость получения и поэтому широко применяются в иммунодиагностике. В то же время, у них есть ряд существенных недостатков, которые ограничивают их использование в отдельных случаях:

  • Уровень отдельных антител в различных образцах поликлонального препарата может изменяться в зависимости от партии;
  • Применение поликлональных тел затруднено, когда необходимо различать две формы (патогенную и непатогенную), которые отличаются друг от друга всего лишь по одному признаку.

Чтобы избавиться от этих недостатков и сделать диагностику более эффективной, были найдены способы получения моноклональных антител. Эти антитела происходят из одной клетки-предшественницы, то есть относятся к одному клеточному клону. Данный вид антител вырабатывается против практически любого вещества (обычно это белки и полисахариды), которое антитело специфически связывает. Моноклональные антитела получили не менее широкое распространение, чем поликлональные, и являются основой для многих лекарственных препаратов. Название таких лекарств оканчивается на –mab (сокращение от Monoclonal AntiBody).

Антитела (другое название – иммуноглобулины) – это особый класс веществ, содержащихся в организме, которые способны избирательно связываться с некоторыми видами молекул. Любая такая молекула, которая специфично связывается с антителом, носит название антигена. Все антитела делятся на несколько классов исходя из их структуры, свойств и особенностей связи с антигенами. В пределах одного класса могут присутствовать несколько разновидностей антител, которые в таком случае называют изотопами. Легкие цепи в молекулах антител бывают двух видов – лямбда и каппа, а тяжелые цепи делятся уже на пять изотопов: G, M, A, D, E. Таким образом, в состав молекул разных классов антител входят легкие и тяжелые цепи с разными изотопическими вариантами.

Поскольку антитела содержатся в сыворотке крови, такую сыворотку называют антисывороткой. Ее обычно получают методом иммунизации организма каким-либо антителом, то есть добавляя в кровь чужеродный объект и вызывая ответную (иммунную) реакцию организма. Как правило, антисыворотка содержит множество различных антител, которые вырабатываются несколькими видами клеток, поэтому она является поликлональной. При этом поликлональная сыворотка может быть моноспецифичной, то есть иметь в своем составе антитела к нескольким вариантам одного и того же антигена. В частности, некоторые препараты на основе поликлональной сыворотки содержат антитела сразу к трем классам тяжелых цепей иммуноглобулинов человека: G, M и A.

Что касается моноклональных антител, то они вырабатываются на основе только одного клона плазмоцитов. Современные достижения клеточной инженерии позволяют получить моноклональные антитела в большом количестве с использованием гибридомной технологии. Гибридомами называют бессмертные клеточные клоны (то есть те, которые способны делиться большое количество раз), вырабатывающие антитела одной специфичности. Их получают в результате слияния клеток двух видов: нормальных клеток, способных к образованию антител, и раковых B-лимфоцитов. После этого гибридомы выделяют и помещают в изолированную среду, где они теряют способность к росту родительских клеток. Благодаря своему «бессмертию», гибридомы в течение долгого времени продуцируют моноклональные антитела. Полученные антитела и препараты на их основе широко применяются в иммунодиагностике, а также в терапевтических процедурах. Данная технология оказала огромное влияние на методы лечения многих заболеваний и принесла своим создателям Нобелевскую премию по медицине.

Антиген регулирует иммунный ответ

Главным регулятором антител является сам антиген: в его присутствии иммунный ответ стимулируется, а при уменьшении концентрации – снижается. Существование такого механизма много кратно подтверждено. Антигены действительно способны стимулировать лимфоциты, взаимодействуя с их поверхностными рецепторами.

Если в организм в ходе иммунного ответа ввести избыток антител и тем самым удалить антиген, то наблюдается резкое падение антителообразования и уменьшение числа клеток, секретирующих антитела.

Читайте также:  Как вылечить коклюш у ребенка в домашних условиях?

Как подготовиться к анализу

Если пациенту назначен анализ на антитела, врач обязательно должен рассказать, зачем проводится исследование и как к нему подготовиться. Состав сыворотки крови человека постоянно меняется. На него влияет образ жизни, особенности питания, психическое состояние.

Пациентам необходимо запомнить следующие правила:

  • забор крови осуществляется утром натощак (только в условиях стационара). Кушать перед анализом запрещено;
  • за 3 суток до анализа нужно отказаться от потребления жирной и жареной пищи, солений и копченостей, концентрированных соков. Категорически запрещено употреблять спиртные напитки и курить. По возможности в подготовительный период рекомендуется отказаться от потребления лекарственных средств;
  • если анализ назначен для определения наличия венерического заболевания, гепатита или паразитных заболеваний, за 2 дня до сдачи биоматериала рекомендуется перейти на молочную диету.

Кровь нельзя сдавать, если за несколько дней до предполагаемого анализа пациент перенес эмоциональное потрясение или стресс. Также существует повышенная вероятность ложного результата, если накануне проводилось ультразвуковое исследование, МРТ или делалась флюорография.

Сколько держится иммунитет после коронавируса

Антикоронавирусная защита формируется у большинства людей, перенесших инфекцию в средней или тяжелой форме. У тех, кто переболел COVID-19 с легким течением иммунный ответ менее напряженный. Это значит, что при повторном контакте с патогеном человек с высокой степенью вероятности заболеет, когда выработка иммуноглобулинов прекратится.

Но медики считают, что в течение 3-4 месяцев антитела после коронавируса надежно защищают переболевших. После тяжелого инфекционного процесса иммунитет сохраняется дольше. А газета The Gardian пишет что после болезни иммунитет защищает так же надежно, как после вакцинации.

Кроме иммуноглобулинов за иммунитет от вируса отвечают также Т-клетки (иммунной памяти). Как пишет A Cell Press journal, при повторном заражении они максимально быстро стимулируют синтез иммуноглобулинов типа G.

Более подробную информацию можно прочитать в нашей статье.

Поделитесь своим мнением либо опытом – пишите комментарии. Понравилась статья? – Поделитесь ею с друзьями в социальных сетях.

Особенности формирования устойчивости организма к новой инфекции еще требуют изучения. Именно поэтому ученые не спешат называть точные цифры, сколько антител должно быть для иммунитета к коронавирусу. Врачи рекомендуют не заниматься расшифровкой результатов ИФА-анализа самостоятельно — лаборатории применяют тест-системы разных производителей. Они имеют разные референсы и технологию анализа. Самое лучшее решение — обратиться к врачу с вопросом о том, сколько антител должно быть после коронавируса и обеспечивает ли выявленный при тестировании уровень иммуноглобулинов надежную защиту от инфекции.

АНФ, симптоматика и прочие лабораторные тесты

Позитивный антинуклеарный фактор обычно предполагает проведение ряда других лабораторных исследований. Конечно, не обходится без общего анализа крови (ОАК), в котором основное внимание направлено на изменение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) – она находится под постоянным контролем (анализ пациенты сдают чаще, нежели сам ОАК). Периодически контролируется РФ (ревматоидный фактор), СРБ (С-реактивный белок – в количественном выражении), АСЛО (антистрептолизин О), антитела к кардиолипиновому антигену (IgG и IgM). Кроме этого, пациенту могут назначаться и более сложные тесты:

  • Скрининговые исследования, направленные на поиск АТ к двухнитевой ДНК (анти-dsDNA), к ядерным антигенам (ANA), к экстрагируемому ядерному антигену, то есть, к различным рибонуклеопротеинам (ENA-скрин);
  • Поиск антинуклеарных антител – IgG с помощью иммуноблоттинга (анти-Sm, RNP/Sm, SS-A, SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, dsDNA, CENT-B, Jo-1, к гистонам, к нуклеосомам, Ribo P, AMA-M2);
  • Определение содержания ЦИК (циркулирующих иммунных комплексов);
  • Исследование компонентов комплемента (С3 и С4).

Очевидно, как антинуклеарный фактор, так и все АНА могут появляться при многих и, следует заметить, довольно не простых патологических состояниях, поэтому и назначаются эти анализы крови только врачом, способным расшифровать и интерпретировать полученный результат. Само исследование обычно не требует особой подготовки (как любой биохимический тест), кроме того, что пациент должен предупредить, какие лекарственные средства он принимает, чтобы врач обозначил время, когда можно сдавать анализ. И еще: курящим пациентам за полчаса до отбора проб настоятельно рекомендуется расстаться со своей привычкой.

Изучение полученных результатов

После проведения всех необходимых процедур – взятия биоматериала и его лабораторной подготовке к исследованию, проводится оценка и интерпретация результатов. Сюда входит определение титра (концентрации) антител и типа свечения. Значимым параметром для диагностики является показатель концентрации свыше 1:160. К примеру, при обострении ревматизма он может превышать отметку 1:640, тогда как в ремиссионном периоде наблюдается понижение до 1:160–1:320.

Тип свечения показывает мишени АНА, что является особо важным клиническим моментом, направляющим последующие действия врача в назначении диагностических мероприятий. По характеру свечения ядер при использовании НЕр-2 определится свыше 20 вариантов ядерного окрашивания, в зависимости от видов присутствующих антител в биоматериале. К основным из них относятся следующие типы свечения.

  • Периферическое. Свечение свидетельствует о наличии анти-ДНК-антител, что подтверждает СКВ. Основным видом антигенов для периферического типа являются гистоновые белки и ДНК.
  • Диффузное (гомогенное). Такое свечение наблюдается при СКВ, сопровождающейся поражением структуры почек и похожих ЗСТ, нефрите, склеродермии, а также лекарственно-индуцированной СКВ. Антигены при данном типе представлены дсДНК, гистонатами и нуклеосомами.
  • Ядрышковое (нуклеарное). Данный тип характерен для системной формы склеродермии, и определяется при присутствии у пациентов антител – PHК полимераза 1, PM/Scl, NOR, U3RNP.
  • Цитоплазматическое. Подобный тип подсвечивания указывает на наличие АНА к тРНК–синтетазам, а именно Jo-1, и наблюдается при полимиозите.
  • Гранулярное. Определяется при синдроме Шегрена, инфекционном мононуклеозе, смешанном ЗСТ (Sharp-синдром, MCTD) и лекарственном волчаночном синдроме. Преимущественно присутствующие антигены для этого типа – SS-A, SS-B, Sm, U1-RNP, и PCNA.
  • Крупногранулярное. Характерно для смешанных ЗСТ и, по мнению многих ученых, связано с наличием антигена RNP.
  • Мелкогранулярное. Определяется присутствие антител, образующихся против рибонуклеиновых белков – АSSP (АЦЦП), SS-A, SS-B и других. Такие антитела характерны для СКВ, также ее специфических кожных формах, ревматоидном артрите, склеродермии, полимиозите, синдроме Шегрена.
  • Центромерное. Данный тип в основном отмечается при склеродермии. Хотя в одном образце крови, особенно у обследуемых с диффузными ЗСТ, в отделенной плазме могут определяться антитела к различным ядерным компонентам.
  • Точечные вкрапления в ядре. Этот тип преимущественно выявляется при болезнях печени аутоиммунного характера. При нем могут сочетаться несколько флюоресцентных типов, к примеру, ядрышковый и мелкогранулярный, что обусловлено антителами к Scl-70.
Читайте также:  Как долго держится высокая температура при бронхите

Справка! Отмечено, что при увеличении разведения плазменного биоматериала параметры свечения могут видоизменяться, так как для многих антител характерна смена активности при разной степени концентрации.

Антитела и их свойства

Антителами называются сывороточные белки, образующиеся в ответ на действие антигена. Они относятся к сывороточным глобулинам, поэтому называются иммуноглобулинами (Ig). Че­рез них реализуется гуморальный тип иммунного ответа. Антитела обладают 2 свойствами:

  • специфичностью, т. е. способностью вступать во взаимодейст­вие с антигеном,  аналогичным тому,  который индуцировал (вызвал) их образование;
  • гетерогенностью по физико-химическому строению, специфич­ности, генетической   детерминированности   образования   (по происхождению).

Все иммуноглобулины являются иммунными, т. е. образуются в результате иммунизации, контакта с антигенами. Тем не менее по происхождению они делятся:

  • на нормальные (анамнестические) антитела, которые обнару­живаются в любом организме как результат бытовой иммуни­зации;
  • инфекционные антитела, которые накапливаются в организме в период инфекционной болезни;
  • постинфекционные антитела,    которые    обнаруживаются    в организме после перенесенного инфекционного заболевания;
  • поствакцинальные антитела, которые возникают после искус­ственной иммунизации.

Антитела (иммуноглобулины) всегда специфичны антигену, индуцировавшему их образование. Тем не менее противомик-робные иммуноглобулины по специфичности делятся на те же группы, что и соответствующие микробные антигены:

  • группоспецифические;
  • видоспецифические;
  • вариантспецифические;
  • перекрестнореагирующие.

В настоящее время довольно часто методами биотехнологии и/или генной инженерии получают иммуноглобулины, продуци­руемые одним клоном кЛеток. Они называются моноклональными антителами. Их продуценты — клетки-гибридомы, являющиеся потомками, полученными при скрещивании В-лимфоцита (плазматической клетки) с опухолевой клеткой. От плазмати­ческой клетки-гибридома наследуется способность к синтезу антител, а от опухолевой клетки — способность длительно культивироваться вне организма.

Помимо специфичности одним из основных свойств иммуно­глобулинов является их гетерогенность, т. е. неоднородность популяции иммуноглобулинов по генетической детерминиро­ванности их образования и по физико-химическому строению.

Методы выявления АНА

Иммунологическая наука к изучению антинуклеарного фактора вплотную подошла к середине прошлого века, а с 1982 года, когда впервые была использована перевиваемая клеточная линия человека HEp-2, ставшая золотым стандартом обнаружения АНА, стали активно дорабатываться и добавляться другие методы. Сейчас иммунология и КДЛ используют несколько методик.

Метод непрямой иммунофлюоресценции, разработанный в самом начале 80-х (1982), на сей день считается наиболее популярным и доступным. Он предполагает участие HEp-2-клеток, извлеченных из опухоли гортани человека. Для определения АНФ выявляются иммуноглобулины класса G (IgG), ибо представители иных классов особой роли не играют. Основа метода – соединение АНА с конкретными ядерными мишенями. Исследование проходит под люминесцентным микроскопом. Расшифровка анализа проводится на основании полученных данных – тип свечения, титр АНА (норма – титр менее 1:160).

Рисунок: типы свечения и диагностические выводы

Методы выявления АНА

Метод двойной иммунодиффузии (качественный анализ) требует большой концентрации АНА, поэтому он менее чувствительный, нежели предыдущий метод. Однако данный недостаток с лихвой компенсируется высокой специфичностью. К тому же, он простой, в какой-то специальной аппаратуре не нуждается, как и в применении антигенов высокой очистки. Разновидность иммунодиффузии – контрэлектрофорез также является качественным методом, позволяющим увеличить чувствительность и сократить время проведения исследования.

Иммуноферментный анализ (ИФА) обладает высокой чувствительностью, обеспечивая быстрый и надежный количественный результат в лабораториях небольших медицинских учреждений. Но при всех достоинствах у иммуноферментного анализа тоже есть свои недостатки: он требует контроля качества, поскольку стандартизация тест-систем и отображаемость результатов основаны на качестве данного исследования.

Возможности иммуноблоттинга в плане чувствительности и специфичности превосходят способности всех предыдущих методов. Он отличается умением выявлять сывороточные АТ к антигенам определенного молекулярного веса, что позволяет не только найти редко встречающиеся антинуклеарные антитела, но и дать им полную характеристику. И еще чем хорош иммуноблоттинг: он не нуждается в высокоочищенных антигенах и не требует контрольных и референсных реагентов. Но и этот метод, не глядя на свое превосходство над остальными, рекомендуется использовать не в изолированном виде, а вместе с другими методами (с целью повышения чувствительности).